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CRISPR-Cas9的改良技術

                                -- 細胞特異性敲除與miNRA-Cas9開關

    近日，日本實驗室發表了有關miRNA-Cas9開關與細胞特異性敲除的報告，他們將Trilink的修飾NTPs 結合到定制的Cas9 mRNA中，用于優化CRISPR Cas9 基因編輯在細胞特異性中的應用。

    目前，以DNA為基礎的基因編輯發展迅速，尤其是CAR-T療法（Novartis’ Kymriah 和 Gilead’s Yescarta）。但在某些應用程序中，成功的限制性因素在于其以細胞類型*的方式運作的能力。研究小組選擇了一種基于RNA的傳遞系統，以克服一些以DNA為基礎的系統相關的安全問題，包括基因組整合系統的安全問題等。

    研究報道：為了調控Cas9的核酸內切酶活性，已有幾種方法，包括光或小分子蛋白誘導系統、組織特異性啟動子系統，和采用split-cas9的轉錄調節電路。但這些報導主要都是使用DNA傳遞方法。

    該研究團隊設計了一個基于mRNA的Cas9開關，該開關是由具細胞特異性的microRNA（miRNA）調控。具體來說，他們引進了miRNA的互補序列到Cas9 mRNA的5'端非編碼區（見圖1），假設通過檢測異質性細胞內的內源性miRNA水平，可以選擇性地控制基因組編輯。當靶基因miRNA缺乏時，Cas9蛋白被翻譯表達，當靶基因miRNA存在時，該蛋白翻譯表達被抑制。

      研究報告顯示，他們miRNA-cas9開關有效地和選擇性地響應了HeLa細胞中的miRNA。同時，使用不同的標記mRNA，在人類誘導多能干細胞（hiPSCs）中都可看到類似的結果。      

    另外，使得驚喜的是，此系統也能夠區分誘導和分化的神經元細胞胞，此功能可能將在臨床應用中起重要作用。

    同時，為進一步優化相關領域，他們提出，可通過含有多個miRNA開關的Cas9系統實現，例如減少泄漏表達等。

     研究小組得出結論：系統應適用于其他Cas9變異（例如同源基因工程蛋白Cas9 / dCas9）和其他miRNA的即插即用方式。”這個功能和易用性可以很好地改良CRISPR-Cas9技術。

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