DynaCompetent® Cells IS-mutation Safe

本產(chǎn)品以DH5α為原株，在大腸桿菌基因組中ISs之間的IS2、IS5、IS10、ISEc63（相似序列）的轉(zhuǎn)座酶翻譯區(qū)使用Target-AID®終止密碼子。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞* 1

* 1雖然 IS 的活性降低，但不保證 IS 不會(huì)轉(zhuǎn)移。

確認(rèn) IS 插入

質(zhì)粒的頻率降低 用耐氨芐青霉s質(zhì)粒 (30 kb, pUC Ori) 轉(zhuǎn)化本產(chǎn)品和大腸桿菌 DH5α 菌株后，進(jìn)行 24 小時(shí)液體培養(yǎng)，最多進(jìn)行 6 次繼代培養(yǎng)。在上述每次培養(yǎng)過(guò)程中純化質(zhì)粒，

并使用HiSeq進(jìn)行下一代測(cè)序以估計(jì)插入IS * 2 * 3, 4的質(zhì)粒的大致比例。

該產(chǎn)品抑制了 IS 插入 DH5α 菌株的質(zhì)粒。

* 2 IS：IS1、IS2、IS3、IS4、IS5、IS10、IS30、ISEc5、IS609、ISEc63的總數(shù)。

* 3 DH5α菌株在+6次傳代培養(yǎng)時(shí)計(jì)算為超過(guò)100%，這表明兩個(gè)或多個(gè)IS插入到一個(gè)質(zhì)粒中。

* 4單獨(dú)將相同質(zhì)粒插入DH5α菌株，傳代6次后分離出9個(gè)克隆，進(jìn)行Sanger測(cè)序，證實(shí)了高IS插入率。

上述質(zhì)粒用BamHI消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。該質(zhì)粒中有2個(gè)BamHI位點(diǎn)，原本產(chǎn)生2個(gè)條帶，但通過(guò)重復(fù)傳代次數(shù)確認(rèn)了在DH5α株中條帶模式發(fā)生了變化。建議將 IS 插入質(zhì)粒。另一方面，用該產(chǎn)物傳代的質(zhì)粒抑制了條帶模式的變化。

DH5α

GFP 熒光在 48.6% 的菌落中消失或減弱

IS-突變安全

GFP 熒光沒(méi)有消失或衰減（沒(méi)有 IS 插入）*5

將該產(chǎn)物和大腸桿菌DH5α菌株用具有在lac啟動(dòng)子控制下的GFP的質(zhì)粒（不同于上述“減少的IS插入質(zhì)粒"圖和遷移圖的質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化。將得到的菌落液體培養(yǎng)18小時(shí)，再傳代6次。繼代培養(yǎng)后，將培養(yǎng)液涂布在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜。在獲得的菌落中觀察到GFP的熒光。

結(jié)果，在DH5α中出現(xiàn)的48.6%的菌落中，GFP的熒光消失或減弱，但在該產(chǎn)物中，沒(méi)有確認(rèn)其中GFP的熒光消失或減弱的菌落。當(dāng)從DH5α菌株中GFP熒光消失或減弱的菌落中提取質(zhì)粒并測(cè)序時(shí)，所有克隆均在lac啟動(dòng)子，或DNA型轉(zhuǎn)座因子IS2或在lac啟動(dòng)子與GFP基因之間插入IS10L。

另一方面，在該產(chǎn)品和來(lái)自熒光DH5α菌落的質(zhì)粒中，從lac啟動(dòng)子到GFP的區(qū)域被完整地保留。

通過(guò)繼代培養(yǎng)，DH5α產(chǎn)生了質(zhì)粒因插入IS而受損的克隆，但證實(shí)該產(chǎn)物抑制了IS對(duì)質(zhì)粒的損傷。

* 5使用本產(chǎn)品，即使是完整的質(zhì)粒，在 LB 板上觀察到的 GFP 的熒光強(qiáng)度也低于 DH5α 的熒光強(qiáng)度（它具有可見熒光）。在該產(chǎn)品中，在 lac 啟動(dòng)子控制下的 GFP 的表達(dá)水平可能低于 DH5α。然而，質(zhì)粒被克隆和純化沒(méi)有任何問(wèn)題。

• 轉(zhuǎn)化效率：> 1 x 10 8 CFU / μg (pUC19)

• 附有 10 × 1 ml SOC 培養(yǎng)基

• 不適用于卡塔赫納法規(guī)